Né le 19 septembre 1933 à Glasgow, David Keith McCallum est le fils d'un violoniste et d'une violoncelliste. Il s'oriente lui aussi vers une carrière musicale, mais bifurque ensuite vers une carrière d'acteur. Après diverses apparitions sur le petit et le grand écran britanniques à la fin des années 50, il se fait remarquer par son rôle dans le film Billy Budd, et intègre la distribution de la grosse production américaine La grande évasion (1963), avec Steve McQueen, James Garner et
Charles Bronson.
Après deux apparitions dans Au-delà du réel, il forme avec Robert Vaughn le duo vedette de la série Des agents très spéciaux, de 1964 à 1968 : Napoleon Solo et Illya Kuryakin deviennent des icônes de la pop culture des années 60. Ils feront à nouveau équipe dans le téléfilm de 1983 Le retour des agents très spéciaux.
Il joue ensuite dans la série dramatique Colditz (1972-1974), puis dans une version actualisée de L'homme invisible (1975-1976). Après diverses apparitions en guest star durant une vingtaine d'années, il tient à nouveau des rôles réguliers : dans la série SF VR.5 (1995-1997), puis dans Nom de code TKR (1997-1998), une tentative de résurrection de K2000, et enfin dans NCIS enquêtes spéciales depuis 2003, où il joue le médecin légiste Donald Mallard. La série entame sa neuvième saison en 2011.
Il a été marié deux fois, a cinq enfants et six petits-enfants. Son fils Valentine McCallum est guitariste, et a composé la musique de trois films de Charles Bronson dans les années 80.

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